分離 LC 峰是否讓您頭疼？

您的方法中的分裂峰是否讓您徹夜難眠？您將在下面找到一些可能導(dǎo)致這些分裂峰的原因，以及如何解決問題。

有幾個(gè)問題需要回答，以確定從哪里開始調(diào)查峰分裂的根本原因。方法中的所有峰都分裂還是只有一個(gè)或幾個(gè)峰分裂？您是否總是在您的方法中觀察到分裂峰，或者它們似乎突然開始發(fā)生？首先弄清楚這些答案可以讓您知道從哪里開始進(jìn)行故障排除。

如果只有*早的洗脫峰分裂，這可歸因于稀釋劑不匹配。這可以通過使用較弱的溶劑稀釋樣品或使樣品稀釋劑與起始流動(dòng)相條件相匹配來解決。這也可以通過注入更少量或使用更大的色譜柱來解決。請(qǐng)參見下面圖 1 和圖 2 中的不匹配稀釋劑示例。

圖 1：使用甲醇作為稀釋劑分析 2 種酰基肉堿的方法條件和色譜圖。

圖 2：使用流動(dòng)相 A 作為稀釋劑分析 2 種酰基肉堿的方法條件和色譜圖。

如果方法中只有一個(gè)或幾個(gè)峰發(fā)生分裂，則要排除的下一個(gè)問題是它實(shí)際上是一個(gè)峰分裂成兩個(gè)，還是它們是共流出峰。可能存在與您的分析物共流出的基質(zhì)干擾。在這種情況下，請(qǐng)嘗試注入空白基質(zhì)樣品以排除任何共流出問題。另一個(gè)原因可能是樣品的濃度或進(jìn)樣量過高，這可能會(huì)導(dǎo)致樣品過載，從而導(dǎo)致分離峰。嘗試注入較小的樣品體積，如果您注意到仍然有兩個(gè)不同的峰，那么可能是時(shí)候回顧一下您的方法并努力調(diào)整條件以提高選擇性。  

另一個(gè)可能導(dǎo)致您的方法出現(xiàn)分裂峰的變量是流動(dòng)相的 pH 值是否太接近分析物的 pKa。一般的經(jīng)驗(yàn)法則是根據(jù)分析物的 pKa 調(diào)整流動(dòng)相 2 個(gè)或更多單位的 pH 值。分裂峰可能是由分析物在特定 pH 下的電離狀態(tài)引起的。如果 pH 值與分析物的 pKa 太接近，則會(huì)出現(xiàn)多種電離狀態(tài)，從而導(dǎo)致分析物出現(xiàn)多個(gè)峰。在這些情況下，嘗試將您的流動(dòng)相 pH 值調(diào)整 +/- 2 并運(yùn)行幾個(gè)樣品，看看這是否有助于峰分裂。

不溶性是另一個(gè)可能導(dǎo)致方法中峰分裂的因素。為避免這種情況，重要的是要確保樣品在稀釋劑和流動(dòng)相中都可溶。如果它不溶于其中之一，它可能會(huì)導(dǎo)致分裂或扭曲的峰。

如果分裂峰在您的方法中通常不是問題，而您突然注意到分裂峰，這可能表明存在幾個(gè)問題。污染是導(dǎo)致分裂峰的另一個(gè)因素。就流動(dòng)相而言，使用新鮮溶液也很重要，如果使用 MS 檢測(cè)，則應(yīng)使用 LC-MS 級(jí)溶劑。僅使用制造商在色譜柱上推薦的流動(dòng)相，并在適當(dāng)?shù)臈l件下清洗和儲(chǔ)存也很重要。